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时间：2023-11-22 浏览次数：51
MALDI-TOF（Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time of Flight）是一种基于飞行时间测量的质谱技术，在微生物学中，MALDI-TOF通过识别物种水平的细菌来帮助检测病原体和分析微生物。然而，MALDI-TOF需要严格的样品处理方法，以确保MS数据中细菌细胞的可重复性。
尽管MALDI-TOF可以通过其蛋白质识别细菌种类，但生成用于细菌鉴定的可重复性MS数据需要许多步骤，这些步骤中的变量，例如样品制备方法、获得的细菌菌落量和菌落的年龄，都会影响MS数据的质量，由于MALDI-TOF中存在许多实验变异源，研究人员越来越多地寻求自动化方法，以尽量减少技术错误。
在MALDI-TOF样品制备流程中引入自动化可以减少了人为错误，提高了可重复性，并提高了研究人员的效率，对于MALDI-TOF MS工作流程，自动化样品处理和物种鉴定方案可以使物种水平的鉴定更具可重复性和准确性，使用 PIXL 高通量菌落挑选工作站可以更快更有效地完成实验。
图1.PIXL菌落提取机器人 [左] 及其内部组件 [上图]，用于MALDI-TOF样品处理的自动化系统
对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乌达纤维素单胞菌和产碱假单胞菌的自动化制备方法进行了测试， 在自动化流程中，使用 PIXL 高通量菌落挑选工作站 （Singer Instruments） 从培养样品中挑选菌落并接种到一次性 MALDI MS 样品板上，例如 FlexiMass-DS 载玻片，将自动化方案与手动制备进行比较，在手动制备中，用接种环点样，通过确定自动化流程，确定使用点种法还是涂片法
采用两种自动细菌转移方法。点种法（最左边）将挑取的样品“轻点”到目标表面上的一个点上，而涂片法（左）则在目标表面上涂抹，形成菌膜.
为了进一步评估自动化流程，还为每种细菌物种挑选了培养板的不同区域.
图3.细菌被挑选的三个区域。绿色是指培养物生长的最厚部分，或“深”。粉红色代表划线培养的“边缘”。黄色是指从划线培养生长最厚的部分挑取（实心箭头，1），然后涂抹在不含任何培养物的琼脂区域，以去除多余的物质，接种到MALDI靶标上（虚线箭头，2）
制备样品后，在iDplus Performance MALDI-TOF质谱仪上分析点种和涂片，并提交至SARAMIS数据库进行鉴定。
为了评估MALDI-TOF的自动采样方法，研究人员对培养板上的三种类型的菌落进行了测试，结果表明，基质溶液的自动涂片和自动单/双点种在鉴定大肠杆菌方面同样准确，置信度为 >99.9%（图 4），相比之下，手动方法的弊端就是引入了增塑剂和其他污染物，这些污染物混淆了用于识别微生物种类的m/z峰。
开发自动化方案，要确定自动样本采集是否可以高置信度地识别其他三种细菌物种。自动化方案允许鉴定其中两个物种，枯草芽孢杆菌、乌达纤维素单胞菌，置信度超过99.9%，虽然枯草芽孢杆菌鉴定有红色 ID，这是由于数据库中的是混合 ID，而不是自动采样方法本身，因此，PIXL自动化和手动方法的数据是最有效的，枯草芽孢杆菌的 MALDI-TOF MS 谱图几乎相同。
图使用自动涂片管道制备的大肠杆菌样品的鉴定结果，用于从培养板的所有区域采集的样品。深绿色 = >99.9% 置信度，浅绿色 = 90.0 – 99.8% 置信度，红色 = 混合 ID，白色 = 无 ID
使用优化的自动化方法时，枯草芽孢杆菌、乌达梭菌和凝聚假单胞菌的物种鉴定结果。深绿色 = >99.9%置信度，浅绿色 = 90.0 – 99.8%置信度，红色 = 混合 ID
具有代表性的 MALDI-TOF MS 谱图，用于使用手动制备的涂片样品（红色）和使用自动方案制备的涂片样品（蓝色）
将自动化集成到研究流程中，可以简化研究方案，并提高生物医学研究的可重复性，在微生物学中，自动化也可用于MALDI-TOF鉴定微生物物种，自动化可以促进样品收集和涂片，这两者都会影响基于MALDI-TOF MS的细菌鉴定的准确性和可重复性。
使用PIXL自动进行菌落挑取和基质沉淀，可以准确并重复地鉴定微生物物种，此外，自动菌落挑取方法生成的MALDI-TOF MS谱图与手动方法产生的谱图相似，因此自动化样本采集方案使MALDI-TOF鉴定更具可重复性。
借助自动化MALDI-TOF MS流程，研究人员可以有效地对微生物进行分型和表征，广泛用于从病原体鉴定到抗生素敏感性测试。
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