海洋微生物与自动化——探索深海领域的另一种可能

生命起源于海洋,地球上的氧气约有一半由海洋光合作用所产生,而叶绿素是光合作用光能捕捉与化学能产生所需的关键分子,光合生命进化出复杂的捕光机制。

海洋真核藻类在大小、颜色和形态上各不相同,但它们的捕光色素-蛋白复合体中大多采用了一种陆地植物所缺乏的、名为叶绿素c的分子。叶绿素c是一类在海洋浮游生物中广泛存在的叶绿素,它的吸收光谱主要集中在蓝绿色光区域,能够吸收波长较短的光线,因此在海洋中发挥了重要的作用。

2023年1124-28日,青岛召开的全国海洋微生物学学术研讨会上,来自西湖大学的李小波团队发表了他在藻类光合作用的代谢合成酶(包括叶绿素、类胡萝卜素),以及在缺氮等逆境条件下,这些色素含量和组成的变化。

▲藻华漩涡。2021年南大西洋的浮游植物藻华漩涡 (绿色和浅蓝色)


早在202310月,李小波团队就在Science发表题为“A chlorophyll c synthase widely co-opted by phytoplankton”(一种被浮游植物广泛选择的叶绿素c合成酶)的文章,首次揭示了叶绿素c合成酶编码基因及该酶作用机制,挖掘了叶绿素c的生理功能,讨论了该基因的演化形成与转移。

▲从藻类中提取的各类色素(作者:李小波教授研究团队)



绿藻在缺氮胁迫下的光合适应 /

莱茵衣藻


莱茵衣藻,是一种单细胞藻类,在缺氮条件下,氮转运能力上调,甘油三酯等脂质积累,可以作为生物能源的前体,为了持续产生甘油三酯,需要有持续的光合作用,但是缺氮会导致黄化,叶绿素降低及能量猝灭。了解这其中的机制后,就可以让藻类在逆境条件下继续光合作用,把能量保持在特定的产物中,来保持产量。

为了寻找这个过程中的基因,因为是单倍体,通过随机插入突变,不需要自交就可以看表型,将抗性基因的DNA转入到莱茵衣藻,在抗性培养基上做筛选,产生76000个突变体。


PIXL&ROTOR+ /

自动化


人工进行筛选肯定不现实,为了提高效率,采用自动化的方式来识别和筛选菌落,并进行随机挑取菌落,将其接种成384阵列,为了维持这个文库,使用384针在琼脂之间复制,可以保存文库,也可以将文库复制到筛选平板上,看表型变化,记录突变体阵列的大小、颜色、荧光等表型。



▲ROTOR+高通量菌落筛选可短时间内操作酵母、真菌、细菌、微藻的高密度阵列,使用无菌复制针板,进行8438415366144密度的高通量筛选,不同密度的文库保存等,PILX自动挑菌设备采用Pinpoint挑取技术,通过超声波自动探测琼脂高度,对每次挑菌进行琼脂表面压力探测挑取随机菌落。

实验筛选了384密度菌落阵列,大约有七万多个突变,可以覆盖微藻一万多个基因和绝大多数非必须基因,获得大约500个突变体有表型特异性,用于后期研究。


结果显示有的黄化慢一点,一直保持绿色,有的黄化快一点,还有能量猝灭,很多突变体无法在缺氮的培养基上生存,有些持续保持绿色的细胞,可能黄化对细胞的生存有保护作用,从突变体中鉴定了很多基因,一部分跟电子传递链相关,也有只知道是个激酶,但作用途径不清楚。








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